《Żvilupp ta 'ġdid medjat minn cas13a / cas12a"One-Pot" doppju Test tal-iskoperta għal uċuħ modifikati ġenetikament espressi
Uċuħ modifikati ġenetikament ġew imħawla b'mod wiesa 'madwar id-dinja, u ħafna pajjiżi tejbu gradwalment il-miżuri regolatorji tagħhom biex jiżguraw is-sigurtà ta' għelejjel ġenetikament modifikati. L-iżvilupp ta 'metodi ta' skoperta ġenetika rapida u preċiżi fuq il-post huwa importanti ħafna għall-agrikoltura u l-bijosikurezza, u jista 'jtaffi t-tħassib pubbliku dwar prodotti modifikati ġenetikament.
F'dan l-istudju, il-grupp ta 'riċerka żviluppa reazzjoni ġdida ta' pot wieħed -- Mira doppju kkombinat ma 'CRISPR doppju (metodu MR-DCA) għall-iskoperta simultanja ta' miri ġenetiċi CAMV35S u NOS f'uċuħ modifikati ġenetikament, li pprovda metodu ta 'skoperta sempliċi u effiċjenti għall-iskoperta ta' uċuħ ġenetikament modifikati.
Metodi sperimentali
Il-prodott doppju Mira huwa analizzat minn sistema doppja CAS13A u CAS12A biex tiġġenera żewġ sinjali indipendenti li ma jinterferixxux ma 'xulxin, u allura l-kulur fluworexxenti jinqara minn strument ta' illuminazzjoni jew minn strixxa tat-test b'żewġ linji T biex tikseb qari ta 'kanali doppju. Il-proċess kollu jitlesta f'inqas minn 35 minuta, b'limitu ta 'skoperta baxx daqs 20 kopja.
(Prinċipju ta 'Sejbien ta' MR-DCA ta 'CAMV35S u NOS)
L-esperiment kollu huwa maqsum fi tliet passi: amplifikazzjoni MIRA, reazzjoni CRISPR, u żewġ metodi ta 'interpretazzjoni tar-riżultati.
Il-ġene CAMV35S jintuża bħala l-mira ta 'CAS13A, u l-ġene NOS jintuża bħala l-mira ta' CAS12A. Żewġ pari ta 'primer Mira ġew iddisinjati rispettivament. Is-sistema CAS13A tirrikonoxxi biss l-RNA, u għalhekk ir-reġjun tal-primer 'il quddiem huwa ddisinjat, li fih promotur T7 għal traskrizzjoni sussegwenti u attivazzjoni ta' CAS13A. Pam huwa miżjud mal-ġene NOS. Iż-żidiet ta 'hawn fuq jiżguraw li kemm il-proteini CAS13A kif ukoll CAS12A jistgħu jorbtu mal-CRRNAs rispettivi tagħhom, u m'hemm l-ebda interferenza jew reazzjoni trasversali bejn iż-żewġ sistemi.
Sitwazzjoni sperimentali
Sensittività u speċifiċità
Il-kampjun ġie dilwit fi gradjent biex tittestja l-intensità tal-fluworexxenza tar-reazzjoni Mira. Instab li l-intensità tal-fluworexxenza xorta tista 'tiġi skoperta f'konċentrazzjoni ta' kampjun ta '20 μL. Il-konċentrazzjoni ta '20 μL ġiet magħżula finalment għall-esperiment.
(Konċentrazzjonijiet differenti tal-kampjun u strixxi tat-test jintużaw għall-iżvilupp tal-kulur u l-kalkolu tal-kwantifikazzjoni tal-intensità)
Biex tkompli tevalwa l-ispeċifiċità tal-MR-DCA, it-tim ta 'riċerka ttestja kampjuni mħallta ta' annimali mhux transġeniċi u pjanti mhux transġeniċi. Ir-riżultati wrew li kampjuni transġeniċi biss li fihom CAMV35s u NOS kellhom sinjali ta 'fluworexxenza għolja, filwaqt li l-intensità tal-fluworexxenza ta' kampjuni oħra kienet qrib dik tal-kontroll negattiv. MR-DCA jista 'jintuża bħala pjattaforma speċifika ta' skoperta ta 'aċidi nukleji doppji.
24 kampjun tal-uċuħ ġew ittestjati mill-MR-DCA. Fost dawn, 1, 2, 15, 16, 21, u 22 hemm qamħ transġeniku li fih il-promotur CAMV35s. 7, 8, 23, u 24 huma ross transġeniku reżistenti għall-mard li fih Terminator NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17, u 18 huma sojja transġeniċi li fihom il-promotur CAMV35S u NOS Terminator.
(Riżultati tat-test ta '24 kampjun)
Reazzjoni rapida
Il-ħin ta 'reazzjoni huwa fattur importanti fl-iskoperta fuq il-post. It-tim ta 'riċerka osserva li s-sinjali tal-fluworexxenza ta' FAM u HEX jistgħu jiġu skoperti minn strument ta 'fluworexxenza meta l-ħin ta' reazzjoni kien ta '10 minuti. Mira flimkien mar-reazzjoni CRISPR osservaw ukoll fluworexxenza isfar wara 15-il minuta.
(Sinjal ta 'fluworexxenza f'ħinijiet differenti ta' reazzjoni Mira)
(L-iżvilupp tal-kulur tal-istrixxi tat-test f'ħinijiet differenti ta 'reazzjoni MIRA u l-kalkolu tal-kwantifikazzjoni tal-intensità)
Konklużjoni sperimentali
Ir-riżultati sperimentali wrew li l-Mira doppja għandha speċifiċità tajba u tista 'tikseb b'mod preċiż il-prodotti ta' amplifikazzjoni ta 'CAMV35s u NOS. Is-sistemi CAS13A u CAS12A jirreaġixxu b'mod indipendenti mingħajr ma jinterferixxu ma 'xulxin. It-test MR-DCA jista 'jinduna b'mod preċiż 20 kopja f'temperatura baxxa ta' 35 minuta, li għandu valur kbir fl-iskoperta ta 'għelejjel ġenetikament modifikati fil-qasam.
Informazzjoni dwar l-Artikolu
Isem tal-Ġurnal: 《Journal of Advanced Research Express
Titolu tal-Artikolu: 《Żvilupp ta 'analiżi ġdida ta' skoperta "One-Pot" medjata minn Cas13A / Cas12A għal uċuħ modifikati ġenetikament modifikati
Fattur tal-Impatt: 11.4
Tim ta 'Riċerka: Wang Xiaofu, Zhejiang Akkademja tax-Xjenzi Agrikoli