It-teknoloġiji dijanjostiċi molekulari llum qed jevolvu b'pass bla preċedent, b'avvanzi sinifikanti matul l-aħħar sentejn. Fost dawn, it-teknoloġiji ta 'amplifikazzjoni iżotermika kisbu aktar attenzjoni minħabba l-kapaċità tagħhom li jwettqu amplifikazzjoni mingħajr il-bżonn ta' tagħmir speċjalizzat. Diversi metodi ta 'amplifikazzjoni iżotermika magħrufa jeżistu, bħal lampa, RPA, u RAA. Madankollu, illum irrid nintroduċi teknoloġija ta 'amplifikazzjoni iżotermika aktar ġdida.
Biex niżguraw li kulħadd ikollu għarfien konsistenti tal-kunċetti ewlenin, hawn xi spjegazzjonijiet fit-terminu:
- Amplifikazzjoni tal-polimerażi recombinase (RPA): Din hija teknoloġija ta 'amplifikazzjoni medjata minn recombinase.
- Amplifikazzjoni megħjuna mir-rikombinase (RAA): metodu simili ta 'amplifikazzjoni medjat minn recombinase.
- Amplifikazzjoni iżotermika medjata minn Loop (LAMP): Teknika oħra ta 'amplifikazzjoni iżotermika.
- Amplifikazzjoni rapida iżotermika b'ħafna aktar (MIRA): teknoloġija ġdida ta 'amplifikazzjoni rapida iżoterma.
Sommarju u kjarifika rapida:
Ħafna jistgħu jistaqsu liema minn dawn il-metodi varji ta 'amplifikazzjoni iżotermika huma aktar affidabbli u stabbli. Fir-realtà, kull teknoloġija għandha s-saħħiet u l-limitazzjonijiet tagħha. Madankollu, il-fatturi ewlenin għall-adozzjoni ta 'suċċess huma l-abbiltà li l-produzzjoni tiġi skalata b'mod affidabbli, bi prezz baxx u prestazzjoni robusta f'applikazzjonijiet differenti.
Issa ser nanalizza fil-qosor kull teknoloġija bbażata fuq dak li naf:
LAMP (amplifikazzjoni iżotermika medjata mill-linja):
Ħafna fil-qasam jafu li LAMP oriġina fil-Ġappun, żviluppat minn Dr Notomi fl-2000 bħala teknika ġdida ta 'amplifikazzjoni tal-ġeni. Bħalissa, is-sjieda ta 'din it-teknoloġija tappartjeni għall-kumpanija Ġappuniża Eiken Chemical Co., Ltd.
Vantaġġi:
- Sensittività għolja (2-5 ordnijiet ta 'kobor ogħla mill-metodi PCR tradizzjonali).
- Ħin qasir ta 'reazzjoni (ir-reazzjonijiet jistgħu jitlestew f'minuti 30-60).
- M’hemmx bżonn ta ’strumenti speċjali fl-użu kliniku (għalkemm turbidimetru f’ħin reali huwa rrakkomandat waqt l-iżvilupp tal-kit).
- Faċli biex topera (kemm jekk tiskopri DNA jew RNA, il-proċess jinvolvi t-taħlit tas-soluzzjoni ta 'reazzjoni, l-enzimi, u l-mudell f'tubu ta' reazzjoni, imbagħad inkubati f'madwar 63 grad għal 30-60 minuti f'banju tal-ilma jew inkubatur, b'riżultati osservabbli mill-għajn mikxufa).
Żvantaġġi:
- Sensittività għolja tista 'tirriżulta f'kontaminazzjoni ta' l-ajrusol ladarba t-tubu jinfetaħ, u jagħmilha mhux xierqa għall-użu barra minn laboratorju PCR minħabba riskju għoli ta 'pożittivi foloz.
- Id-disinn tal-primer huwa ta 'sfida, li jagħmilha mhux xierqa għal xi mard, speċjalment dawk ikkawżati minn viruses bi ftit sekwenzi komuni.
- L-applikazzjoni tagħha hija relattivament limitata.
Teknoloġiji ta 'amplifikazzjoni iżotermika RPA u RAA:
Dawn iż-żewġ metodi huma fil-biċċa l-kbira omologi, bid-differenza ewlenija hija s-sors tar-rikombinasi użata.
- Ir-rikombinase ta 'RPA ġejja mill-batterjofage T4.
- Ir-rikombinasi tar-RAA hija derivata minn batterji jew fungi.
Punti ewlenin tal-prinċipju tax-xogħol:
1. Fil-preżenza ta 'ATP, ir-rikombinase torbot ma' primer, li tifforma kumpless ta 'aċidu nukleiku proteina, li mbagħad tfittex li tqabbel id-DNA fil-mira.
2. Ladarba l-primer isib il-mudell tad-DNA li jaqbel, l-idroliżi ATP tipprovdi l-enerġija għal recombinase biex tħalli l-primer, u d-DNA polimerażi tissintetizza linja tad-DNA ġdida.
3. Fl-istess ħin, proteini li jorbtu d-DNA (SSB) b'suq wieħed jorbtu mal-linja tad-DNA spostata biex tevita r-riformazzjoni tal-linja doppja.
Vantaġġi:
- Ir-reazzjoni RPA / RAA hija mgħaġġla ħafna, bir-riżultati li jistgħu jinkisbu f'madwar 30 minuta.
- Is-sensittività tista 'tilħaq 10 kopji / μl.
- M’hemmx bżonn ta ’tagħmir kumpless waqt l-amplifikazzjoni.
- Żvilupp ulterjuri ta 'metodi ta' kromatografija tad-deheb ibbażati fuq is-sonda jew kollojdali jissimplifika bil-kbir l-interpretazzjoni tar-riżultati, u jagħmilhom adattati tajjeb għall-użu f'żoni limitati fir-riżorsi jew ekonomikament żvantaġġati.
Żvantaġġi:
- L-RPA hija teknoloġija żviluppata mill-kumpanija Ingliża Twistdx, li issa hija proprjetà ta 'Abbott, li tirriżulta fi spejjeż għoljin, ċikli ta' provvista twal, u nuqqas ta 'appoġġ tekniku. Dan jagħmel applikazzjoni fuq skala kbira u produzzjoni tal-massa diffiċli fiċ-Ċina.
- RAA hija teknoloġija purament domestika, iżda hija nieqsa mill-istabbiltà f'termini ta 'reżistenza għall-interferenza u konsistenza tar-reaġent tal-prodott. Barra minn hekk, il-proċess tal-manifattura għal enzimi funzjonali jeħtieġ titjib. Għalkemm it-teknoloġija ilha fis-suq għal ħames snin, għadha ma ġietx adottata b'mod wiesa 'minħabba kwistjonijiet ta' stabbiltà u versatilità.
- Kemm RPA kif ukoll RAA jeħtieġu primer li huma 30-35 bp fit-tul. Primers iqsar jaffettwaw l-ispeċifiċità, is-sensittività, u l-veloċità tal-amplifikazzjoni, u jagħmlu d-disinn tal-primer sfida.
MIRA (amplifikazzjoni rapida iżotermali multienzyme):
Mira hija teknoloġija ta 'amplifikazzjoni iżotermika ġdida introdotta f'nofs -2019. Huwa omologu għal RPA u RAA.
Għalkemm Mira taqsam ix-xebh ma 'RPA u RAA f'termini ta' prinċipji ta 'ħidma, hemm differenzi sinifikanti fl-għażla tal-enzimi, il-kultivazzjoni, il-purifikazzjoni, u aspetti oħra tal-produzzjoni fuq skala kbira. Barra minn hekk, it-tim tekniku wara l-iżviluppatur ta 'Mira, Ampfuture, qatta' kważi 11-il sena jipperfezzjona t-teknoloġija. Issa huwa mgħammar bis-sħiħ biex jappoġġja l-iżvilupp ta 'reaġenti lesti għall-użu, żvilupp tad-dwana, proġetti ta' riċerka, u servizzi oħra li jistgħu jiġu personalizzati.
Vantaġġi:
1. Il-proteini funzjonali fir-reaġenti Mira jinxtraw minn diversi enzimi, b'xi enzimi għaddejjin minn modifiki mmirati biex itejbu l-effiċjenza tas-sistema tal-enzimi ewlenin, li tirriżulta f'sistema aktar komprensiva.
2. Reżistenza qawwija ta 'interferenza u stabbiltà. Ir-reaġenti MIRA jgħaddu minn ottimizzazzjoni estensiva f'termini ta 'għażla u konċentrazzjoni tal-kofatturi, flimkien ma' proċessi ta 'produzzjoni li tnixxef l-iffriżar, li jagħmluhom aktar reżistenti għall-interferenza u aktar stabbli.
3. Personalizzazzjoni u versatilità. Minħabba kontroll sħiħ fuq il-produzzjoni ta 'proteini funzjonali u fehim profond tat-teknoloġija, Mira tista' tiġi adattata għal diversi applikazzjonijiet, li toffri sistemi ta 'reaġent differenti u servizzi ta' personalizzazzjoni personalizzati.
4. Privattivi proprjetarji. Peress li Mira huwa żviluppat 100% domestikament, m'hemm l-ebda riskju ta 'ksur tal-privattivi waqt l-iżvilupp tal-prodott. Dan jagħti lil Mira vantaġġ kompetittiv kemm fis-swieq domestiċi kif ukoll internazzjonali.
5. Ġie stabbilit protokoll ta 'produzzjoni komplet, li jippermetti produzzjoni stabbli fuq skala kbira.
Żvantaġġi:
1. Ir-rikonoxximent tas-suq għadu baxx, u aktar dejta u referenzi minn oqsma differenti (bħal rati pożittivi f'oqsma differenti) huma meħtieġa biex tinkiseb aċċettazzjoni usa '.
2. Id-disinn tal-primer għadu jsegwi l-karatteristiċi ta 'RPA jew RAA, li jeħtieġu sekwenzi ta' primer jew sonda itwal, li jistgħu ma jiffaċilitawx swiċċ malajr għall-utenti attwali tal-PCR.